Pfu DNA Polymerase（含超純dNTP）PCR相關(guān)
Pfu DNA Polymerase 是從克隆有DNA Polymerase 基因的大腸桿菌中分離純化的， Pfu DNA Polymerase具有5′-3′DNA聚合酶活性和3′-5′外切酶活性，能糾正DNA擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的堿基錯配。Pfu酶是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫DNA Polymerase中出錯率zui低的。Pfu DNA Polymerase（含超純dNTP）PCR相關(guān)
Pfu DNA Polymerase (含超純 dNTP)
Pfu DNA Polymerase（含超純dNTP）PCR相關(guān)
目錄號：:71013
產(chǎn)品內(nèi)容
產(chǎn)品成份 | 71013-0500 | 71013-03000 |
Pfu DNA Polymerase（5U/µl） | 500 U | 3000 U |
10× Pfu Buffer+（with MgSO4） | 1 ml | 6×1ml |
SuperPure dNTP mix（10 mM） | 0.2 ml | 1.2 ml |
保存條件
-20℃保存，有效期 2 年。
經(jīng)常使用，可置于 4 °C 保存，有效期 3 個月。
產(chǎn)品簡介
Pfu DNA Polymerase 是從克隆有DNA Polymerase 基因的大腸桿菌中分離純化的， Pfu DNA Polymerase具有5′-3′DNA聚合酶活性和3′-5′外切酶活性，能糾正DNA擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的堿基錯配。Pfu酶是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫DNA Polymerase中出錯率zui低的。其PCR產(chǎn)物為平端，可直接用平端載體克隆。
活性單位:
1 單位（U）Pfu DNA Polymerase 活性定義為在 74℃、30 分鐘內(nèi)，以活性化的大馬哈魚精子 DNA 作為模板引物，將 10 nmol 脫氧核苷酸摻入到酸不溶物質(zhì)所需的酶量。
質(zhì)量控制:
SDS-PAGE 檢測純度大于 99%，經(jīng)檢測無外源核酸酶活性；PCR 方法 檢測無宿主殘余 DNA，能有效地擴(kuò)增人基因組中的單拷貝基因；室溫存放一周，無明顯活性改變。
酶貯存緩沖液：
50mM Tris-HCl(pH 8.2)，0.1mM EDTA，1mM DTT，Stabilizers，50% glycerol。
10×Pfu Buffer (含Mg2+)：
200 mM Tris-HCl (pH8.8)，100 mM KCl，100 mM(NH4)2 SO4，20 mM MgSO4，其他成分。
適用范圍：
用于DNA的高保真擴(kuò)增，如基因表達(dá)克隆、基因定點突變、細(xì)胞內(nèi)基因點突變分析（SNP）和平末端補(bǔ)平等。
注意事項：
1. Pfu酶具有3′-5′的外切酶活性，所以Pfu酶擴(kuò)增時延伸速度比Taq酶低，應(yīng)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的長度設(shè)置相應(yīng)的延伸時間，如果擴(kuò)增片段小于4 kb，建議Pfu酶的延伸速度為1kb / min；如果擴(kuò)增片段大于4 kb，建議延伸速度為0.5kb / min。同時Pfu酶的3′-5′的外切酶活性可能降解引物， 所以應(yīng)先加dNTP后，再加Pfu酶到反應(yīng)體系中，并立即進(jìn)行PCR反應(yīng)。
2. 用Pfu酶擴(kuò)增時，引物的純度要求較高，引物長度大于18個堿基，Tm在55－80℃ 之間，引物濃度在0.1-0.5 μM之間，比Taq酶略高。
3. Pfu酶的熱穩(wěn)定性比Taq酶好，對于GC含量很高的模板，變性溫度可以提高到98℃，對Pfu酶的活性無影響。
4. 高保真PFU對于dNTP純度要求很高，因此建議用本酶配套的超純dNTPmix。
Pfu DNA Polymerase的使用說明：
一、 配制 PCR 反應(yīng)體系：(于冰上配制)
Component | 20μl Reaction | 50μl Reaction | 終濃度 |
Template DNA | as required | as required | 10pg-0.5μg |
Forward Primer (10 μM) | 0.4 μl | 1 μ | 0.2 μM |
Reverse Primer (10 μM) | 0.4 μ | 1 μl | 0.2 μM |
10×Buffer（withmgcl2） | 2 μ | 5 μ | |
Pfu DNA polymerase(5U/μl) | 0.2 μl | 0.5μ | |
ddH2O | up to 20 μl | up to 50 μ |
參考模板用量（50 μl 反應(yīng)體系）：
質(zhì)粒：0.1-10 ng；細(xì)菌基因組：10-100 ng；人類基因組：50-150 ng；cDNA：1-5 μl from RT。
二、 設(shè)置 PCR 循環(huán)條件：（請根據(jù)實際情況適當(dāng)調(diào)整）
Step | Temperature | Time | Cycle Number |
Initial denaturation | 94℃ | 3 minutes | |
Denaturation | 94℃ | 30 seconds |
30-35 cycles |
Annealing | 50-60℃ | 30 seconds | |
Extension | 72℃ | 0.5-1kb / minute | |
Final Extension | 72℃ | 5 minutes | |
4-8℃ | Hold |
三、結(jié)果檢測：反應(yīng)結(jié)束后取 5 µl 反應(yīng)產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳檢測。
Pfu DNA Polymerase（含超純dNTP）PCR相關(guān)
